玉研香煙染毒系統(tǒng) | 自動、靈活、安全建立香煙暴露小鼠模型——助力慢阻肺的病理研究

慢性阻塞性肺疾?。璺?，COPD）是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和（或）肺氣腫，可進(jìn)一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭的常見慢性疾病。其致殘率和病死率居高不下，全球40歲以上人群中的發(fā)病率已高達(dá)9%～10%，嚴(yán)重危害著人們的健康。

慢阻肺以持續(xù)氣流受限為特征，這種氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺臟對有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。氣流受限和氣道阻塞作為該疾病最重要的病理生理改變，其確切病因尚不完全明了，但普遍認(rèn)為是由個體易患因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。許多患者還常常伴隨其他有臨床癥狀的慢性病，這無疑增加了慢阻肺的發(fā)病率和病死率。

在探討慢阻肺的病因時，我們不得不提的是吸煙這一最常見和最主要的危險因素。長期吸煙不僅直接損害呼吸道，還可能導(dǎo)致職業(yè)性粉塵和化學(xué)氣體等其他有害物質(zhì)的吸入風(fēng)險增加，從而加劇慢阻肺的發(fā)生。香煙中的有害物質(zhì)通過誘導(dǎo)氣道上皮炎癥反應(yīng)，破壞上皮屏障，促進(jìn)免疫細(xì)胞的聚集，并導(dǎo)致粘液分泌過多和小氣道壁的重塑。

近期，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院肺病危重癥醫(yī)學(xué)科張靜教授團(tuán)隊(duì)在國際權(quán)威期刊上Free Radical Biology and Medicine發(fā)表一篇題為“ROS induced the Rab26 promoter hypermethylation to promote cigarette smoking-induced airway epithelial inflammation of COPD through activation of MAPK signaling”的文章。他們發(fā)現(xiàn)，香煙暴露會導(dǎo)致肺組織的表觀遺傳改變，這種改變與慢阻肺的慢性炎癥緊密相關(guān)。其中，DNA甲基化作為控制表觀遺傳轉(zhuǎn)錄的主要方式，在吸煙影響下的變化尤為關(guān)鍵。吸煙通過調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，進(jìn)而影響到慢阻肺的發(fā)病過程。

此外，研究還揭示了香煙暴露下氣道炎癥反應(yīng)的更深層次機(jī)制。香煙產(chǎn)生的活性氧（ROS）在這一過程中扮演著重要角色。ROS不僅調(diào)節(jié)DNMTs的表達(dá)，還影響到p53和Bcl2的功能，最終導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞的凋亡。盡管ROS在調(diào)控基因甲基化/去甲基化過程中的具體機(jī)制尚不完全清楚，但這一發(fā)現(xiàn)無疑為我們理解慢阻肺的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。

值得一提的是，Rab蛋白作為調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要分子，在肺部炎癥中也發(fā)揮著不可忽視的作用。特別是Rab26，它被發(fā)現(xiàn)能夠抑制炎癥信號，減弱肺內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。然而，在香煙暴露后，Rab26的作用機(jī)制及其與氣道炎癥的關(guān)系仍待進(jìn)一步揭示。

這項(xiàng)研究不僅深化了我們對慢阻肺發(fā)病機(jī)制的理解，也為未來的治療提供了新的思路。通過深入研究ROS和Rab26等分子在氣道炎癥反應(yīng)中的作用，我們有望開發(fā)出更為有效的預(yù)防和治療策略，為慢阻肺患者帶來福音。

文中提到，在卷煙暴露條件下，ROS通過促進(jìn)DNMT3b介導(dǎo)的Rab26啟動子DNA甲基化來抑制Rab26的表達(dá)，下調(diào)Rab26的表達(dá)可增強(qiáng)p38和JNK MAPK信號的激活，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生；NAC（N-乙酰半胱胺酸）恢復(fù)Rab26也可減輕香煙暴露誘導(dǎo)的氣道上皮炎癥反應(yīng)

研究者首先建立了香煙暴露小鼠模型，使用全身香煙煙霧暴露系統(tǒng)，將小鼠（n = 5）暴露于20支香煙中，每天兩次，每周6天，持續(xù)2小時，持續(xù)三個月。對照組（n = 5）保持在相同的環(huán)境中，包括相同的食物量，不接觸香煙。全身香煙煙霧暴露系統(tǒng)由上海玉研儀器提供，配備全自動香煙煙霧發(fā)生器、暴露箱體和層流生物安全柜。為避免操研究者接觸二手煙，暴露箱體設(shè)置在層流生物安全柜內(nèi)，香煙由自動香煙煙霧發(fā)生器產(chǎn)生，并被泵入暴露箱。隨后采集小鼠肺和支氣管肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行H&E染色、免疫組化（IHC）和炎癥介質(zhì)測定。同時測定小鼠的體重、白細(xì)胞計數(shù)、Hct和HbCO水平。

香煙暴露誘導(dǎo)氣道上皮炎癥反應(yīng)

香煙暴露染毒的氣道炎癥反應(yīng)是COPD的一個主要特征。在此，研究者評估了體內(nèi)和體外香煙暴露氣道上皮的炎癥反應(yīng)。H&E染色顯示，香煙暴露小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管周圍出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞（圖.1A）。此外，肺泡空間擴(kuò)大和破壞（圖.1A）。病理改變與吸煙相關(guān)的COPD和肺氣腫一致。全身香煙暴露小鼠的全身性炎癥水平也被評估。與對照組相比，全身暴露小鼠的BALF IL-8和IL-6水平顯著升高（圖.1B＆C）。

圖1.香煙暴露誘導(dǎo)體內(nèi)和體外炎癥反應(yīng)

香煙暴露抑制了Rab26在氣道上皮中的表達(dá)

數(shù)據(jù)顯示，在COPD患者的樣本中，肺組織中Rab26水平的PKM明顯低于非COPD患者（圖.2A）.IHC數(shù)據(jù)顯示，香煙暴露的小鼠的肺氣道上皮細(xì)胞中Rab26的表達(dá)低于對照組小鼠（圖.2B）.此外，與對照組相比，香煙暴露的小鼠肺組織中Rab26的表達(dá)降低（圖.2C）。

圖2.香煙暴露抑制了Rab26在體內(nèi)和體外的表達(dá)

DNMT3b調(diào)控Rab26的表達(dá)

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase， DNMT）家族成員在介導(dǎo)基因DNA甲基化中起關(guān)鍵作用。因此，研究者探索了DNTM3B在香煙暴露誘導(dǎo)的Rab26啟動子DNA甲基化中的作用。研究者發(fā)現(xiàn)DNMT3B在香煙暴露小鼠肺組織中的表達(dá)增加（圖.3A）。免疫組化分析還顯示，與對照組相比，香煙暴露組氣道上皮DNMT3B水平升高（圖.3B）。

圖3.Rab26抑制香煙暴露誘導(dǎo)的起到上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)

ROS通過調(diào)控DNMT3b抑制Rab26的表達(dá)

為了確認(rèn)ROS對Rab26表達(dá)的影響及其通過啟動子甲基化的潛在機(jī)制，研究者將細(xì)胞用不同劑量的H₂O₂（一種ROS）處理2小時。數(shù)據(jù)顯示H₂O₂增加DNMT3B蛋白的產(chǎn)生，抑制Rab26的表達(dá)（圖.4E）。與上述結(jié)果一樣，NAC預(yù)孵育細(xì)胞后，H₂O₂存在下Rab26的下調(diào)表達(dá)得到部分恢復(fù)（圖.4F）。熒光素酶檢測顯示H₂O₂抑制Rab26啟動子的活性（圖.4G）。這些數(shù)據(jù)表明，香煙暴露誘導(dǎo)的ROS抑制了Rab26啟動子的活性，下調(diào)了Rab26的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。而NAC能部分逆轉(zhuǎn)香煙暴露對Rab26表達(dá)的抑制作用。

圖4.ROS通過調(diào)控DNMT3b抑制Rab26的表達(dá)

抗氧化劑增強(qiáng)Rab26表達(dá)，減輕COPD小鼠的炎癥反應(yīng)

體外實(shí)驗(yàn)顯示，香煙暴露誘導(dǎo)的氧化劑導(dǎo)致上皮細(xì)胞中Rab26的生成減少，炎癥增加，而NAC（N-乙酰半胱胺酸）是目前廣泛應(yīng)用于治療COPD患者。本研究通過NAC證實(shí)抗氧化劑對體內(nèi)Rab26表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以及提高肺組織中Rab26表達(dá)對COPD小鼠炎癥反應(yīng)的影響。H&E顯示NAC改善了鰓周區(qū)域的炎癥細(xì)胞浸潤（圖.5A）。圖7B顯示，小鼠在香煙暴露期飲用NAC溶液后，Rab26表達(dá)升高，DNMT3b水平下降。同樣，與香煙暴露組相比，NAC/香煙暴露組肺氣道上皮中Rab26表達(dá)升高，DNMT3b表達(dá)降低（圖.5C）。此外，NAC處理抑制香煙暴露誘導(dǎo)的IL-8和IL-6的BALF水平（圖.5D＆E）。這些數(shù)據(jù)表明，ROS可能通過促進(jìn)DNMT3b介導(dǎo)的DNA甲基化和改善香煙暴露誘導(dǎo)的COPD小鼠炎癥反應(yīng)中Rab26的表達(dá)來抑制Rab26。

圖5.抗氧化劑增強(qiáng)了Rab26表達(dá)，減輕COPD小鼠的炎癥反應(yīng)

在構(gòu)建慢性阻塞性肺疾?。?/span>COPD）的動物模型時，玉研儀器精心選擇了一些關(guān)鍵的造模參數(shù)，以確保模型的準(zhǔn)確性和可靠性。

首先，考慮到香煙暴露作為COPD發(fā)病的主要因素，因此需設(shè)定精確的香煙暴露條件。通過控制香煙煙霧的濃度、暴露頻率和持續(xù)時間，可以成功模擬出長期吸煙對肺組織的損害作用。

其次，為了模擬COPD患者肺部炎癥的復(fù)雜環(huán)境，引入了多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的刺激。這些介質(zhì)和因子的種類、濃度和作用時間均經(jīng)過精心調(diào)整，以最大程度地模擬COPD患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

此外，還需注重模擬COPD患者肺部氣流受限的特征。通過調(diào)整氣道阻力、肺順應(yīng)性和通氣功能等參數(shù)，可以成功構(gòu)建具有氣流阻塞特征的COPD模型。

在整個造模過程中，嚴(yán)格遵循科學(xué)原則，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。同時，研究者還需注重動物福利和倫理原則，確保實(shí)驗(yàn)過程對動物的傷害最小化。

通過這些精心設(shè)計的造模參數(shù)，可以成功構(gòu)建能夠真實(shí)反映COPD病理生理改變的動物模型，為后續(xù)的研究提供了有力的工具：

1、僅用香煙暴露進(jìn)行小鼠造模：待小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境后，被隨機(jī)分配到四個組：對照組、PM2.5組、吸煙組和PM2.5+吸煙組，每組有7只小鼠。對照組小鼠僅暴露在室內(nèi)空氣，無PM2.5。PM2.5組小鼠通過超聲波霧化器吸入PM2.5（濃度為110 μg/m³）。吸煙組小鼠在香煙暴露染毒箱內(nèi)吸入香煙煙霧（在2.5小時內(nèi)消耗10支香煙）。PM2.5+吸煙組小鼠同時暴露于PM2.5和香煙煙霧中。暴露方式：所有小鼠每周5天，每天兩次接受上述處理，持續(xù)10個月。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠被處死，并收集肺組織進(jìn)行分析。

2、香煙暴露聯(lián)合氣道內(nèi)滴注脂多糖方法進(jìn)行造模：持續(xù)時間8周，除空白組外，其余各組小鼠置于自動小動物熏煙箱中，將香煙插入自動點(diǎn)煙盒，點(diǎn)燃后打開微型真空泵，將煙霧引入暴露箱體中。每天進(jìn)行香煙暴露兩次，間隔3小時，每次點(diǎn)煙8支，煙霧最大濃度狀態(tài)維持30min。（備注：每次30min熏煙過程中可間隔15min適當(dāng)通入少量氧氣，警惕小鼠缺氧死亡）熏6天停1天，連續(xù)熏煙8周。在第1、14、21天用10%水合氯醛0.3ml/100g對各組小鼠進(jìn)行腹腔麻醉，后切開頸部皮膚，暴露氣管，空白組予0.2ml生理鹽水氣道內(nèi)注射，其余各組予濃度為1mg/ml的脂多糖0.2ml氣管注射（注射當(dāng)日不熏煙）。

產(chǎn)品推薦：

相關(guān)產(chǎn)品推薦

EMMSLink WBP清醒動物全身體積描記系統(tǒng)為COPD研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。WBP系統(tǒng)能在動物清醒狀態(tài)下對其呼吸功能進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，精確捕捉氣道反應(yīng)性、肺容量等關(guān)鍵指標(biāo)的變化，從而深入揭示COPD的病理生理機(jī)制。此外，系統(tǒng)還配備了霧化給藥功能，使得研究人員能夠同步進(jìn)行藥物吸入實(shí)驗(yàn)，快速而準(zhǔn)確地評估藥物對COPD的治療效果。

通過應(yīng)用EMMSLink WBP系統(tǒng)，研究人員可以更加全面地了解COPD的發(fā)展過程，包括疾病進(jìn)展、氣道炎癥和氣流受限等方面的變化。這不僅有助于研究者更深入地認(rèn)識COPD，還為制定更加精準(zhǔn)和有效的治療策略提供了重要的參考依據(jù)。（需圖片）

EMMS FM用力肺功能檢測系統(tǒng)在肺功能檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出了卓越的性能和廣泛的應(yīng)用價值。該系統(tǒng)專為慢阻肺（COPD）、肺間質(zhì)、肺氣腫、肺纖維化、矽肺、急性肺損傷、機(jī)械通氣型肺損傷等研究而設(shè)計，為科研人員提供了精準(zhǔn)的肺功能檢測手段。

同時，FM系統(tǒng)具備全面的生理指標(biāo)參數(shù)檢測能力，如FEV(x)、FEF(x)、FVC、FRC、MMEF、TLC等，能夠全面反映肺功能狀態(tài)，為疾病的診斷和治療提供有力依據(jù)。

此外，FM系統(tǒng)還兼具彌散功能和氣道阻力及順應(yīng)性測量等功能，可廣泛應(yīng)用于各種臨床前研究。其精準(zhǔn)度和穩(wěn)定性都得到了廣大用戶的認(rèn)可和好評。（需圖片）

COPD造模過程中，往往需要模擬肺部疾病的病理生理過程，特別是肺部炎癥和氣流受限的特征。通過使用上海玉研儀器肺部霧化給藥裝置，研究人員可以精確地模擬藥物在肺部的作用過程，觀察藥物對肺部炎癥和氣流受限的影響，從而更準(zhǔn)確地評估藥物的療效和安全性。

肺部霧化給藥裝置具有可定量、直接肺部霧化給藥的特點(diǎn)，能夠確保給藥量的準(zhǔn)確性和一致性，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可靠性。（需圖片）

用戶名單

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所

中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所

四川大學(xué)

上海交通大學(xué)

上海中醫(yī)藥大學(xué)

南京中醫(yī)藥大學(xué)

廣州醫(yī)科大學(xué)

安徽醫(yī)科大學(xué)

河南中醫(yī)藥大學(xué)

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)

沈陽醫(yī)學(xué)院

桂林醫(yī)學(xué)院

上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心

山東省中醫(yī)藥研究院

廈門聯(lián)合呼吸健康研究院

北京大學(xué)第三醫(yī)院

北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院

天津醫(yī)科大學(xué)總院

南京市第一醫(yī)院

蘇州市立醫(yī)院

湖州市中心醫(yī)院

衢州市人民醫(yī)院

吉林大學(xué)附屬第一醫(yī)院

山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司

三生國健藥業(yè)（上海）股份有限公司

澎立生物醫(yī)藥技術(shù)（上海）有限公司

益諾思生物技術(shù)南通有限公司